Biochemistry – Biochimica

Tipologia

Discipline fondamentali applicate alle biotecnologie

SSD

BIO/10

Anno

1º anno

Semestre

1º semestre

CFU

3

Distribuzione delle ore

24 classroom hours

Docenti

ROBERTO CONTESTABILE

Tipologia

Discipline fondamentali applicate alle biotecnologie

SSD

CHIM/06

Anno

1º anno

Semestre

1º semestre

CFU

3

Distribuzione delle ore

24 classroom hours

Docenti

FABRIZIO VETICA

Obiettivi Generali

Al termine del corso e al superamento dell’esame, lo studente avrà acquisito le conoscenze e competenze nelle tematiche sotto riportate. Lo studente sarà in grado di descrivere la struttura di una collezione di enzimi, rappresentativi dei principali meccanismi di reazione della chimica bio-organica e delle classi enzimatiche, utilizzando programmi di visualizzazione e analisi interattive di macromolecole biologiche. Lo studente sarà in grado di prevedere, in base alla struttura dei siti attivi degli enzimi rappresentativi, il loro meccanismo di azione e di accelerazione della velocità di reazione, utilizzando le principali metodiche di indagine cinetica sperimentali.

Obiettivi Specifici

a) conoscenza e capacità di comprensione:
attraverso le lezioni ed esercitazioni lo studente dovrà conoscere e comprendere il rapporto tra struttura e funzione delle principali classi di enzimi coinvolti nelle reazioni metaboliche della cellula; dovrà comprendere la base strutturale della accelerazione della velocità; dovrà essere in grado di accedere alle banche dati delle strutture delle macromolecole biologiche;

b) capacità di applicare conoscenza e comprensione:
lo studente sarà in grado di utilizzare i principali paradigmi teorici per interpretare i meccanismi di reazione degli enzimi, e di applicare le conoscenze acquisite per la predizione delle principali caratteristiche meccanicistiche di enzimi nuovi;

c) autonomia di giudizio:
lo studente dovrà essere in grado di descrivere in piena autonomia il meccanismo di una reazione chimica catalizzata da un enzima, evidenziandone le caratteristiche distintive e suggerendo gli esperimenti atti a dimostrarne il meccanismo;

d) abilità comunicative:
lo studente dovrà avere la capacità di presentare e spiegare i meccanismi di azione degli enzimi, basati sul rapporto struttura-funzione determinato sperimentalmente, ed utilizzando correttamente e con rigore il linguaggio scientifico e tecnico;

e) capacità di apprendimento:
lo studente sarà in grado di esaminare in senso critico gli argomenti di corso, di proporre strategie sperimentali nuove ed indipendenti ove possibile, di aggiornarsi tramite la consultazione delle banche dati bibliografiche e strutturali (es. PubMed e RCSB Protein Data Bank).

Modulo Bioorganic reaction mechanisms
Obiettivi Generali
Al termine del corso e al superamento dell’esame, lo studente avrà acquisito le conoscenze e competenze nelle aree sotto riportate. In generale sarà in grado di descrivere la struttura e reattività dei principali gruppi funzionali dei composti organici ed in particolare di quelli presenti nelle molecole biologiche. Sulla base delle conoscenze acquisite lo studente sarà in grado di prevedere, in base alla struttura chimica dei composti organici, la loro reattività e descrivere i meccanismi di reazione in cui i composti sono coinvolti, sia in applicazione delle più comuni metodologie chimico-organiche, sia con una diretta correlazione ad esempi di meccanismi biochimici in cui le stesse reazioni sono catalizzate da processi enzimatici. In futuro lo studente potrà contare sulle conoscenze e competenze appena descritte per la comprensione e l’interpretazione su base chimico-organica dei principali processi biochimici coinvolti in tutti gli ambiti della biochimica e di altre discipline.

Obiettivi Specifici
a) conoscenza e capacità di comprensione:
Conoscenza e comprensione del rapporto tra struttura molecolare e reattività dei principali gruppi funzionali coinvolti in reazioni organiche e processi biochimici; comprensione della logica chimica nei meccanismi di reazione;
b) capacità di applicare conoscenza e comprensione:
capacità di interpretare e spiegare i meccanismi di reazione delle principali reazioni organiche; capacità di applicare le conoscenze a processi enzimatici che coinvolgono tali meccanismi di reazione;
c) autonomia di giudizio:
saper interpretare autonomamente il meccanismo di una reazione organica; saper individuare tali meccanismi nei processi biochimici; saper valutare la reattività delle molecole organiche e delle principali molecole biologiche in base alla presenza di gruppi funzionali;
d) abilità comunicative:
saper illustrare e spiegare i meccanismi delle reazioni organiche con termini appropriati e con rigore logico; saper riprodurre le principali strutture molecolari di molecole organiche e delle principali molecole biologiche;
e) capacità di apprendimento:
acquisizione dei fondamenti e degli strumenti cognitivi per proseguire autonomamente nell’approfondimento della chimica bioorganica e della biochimica; acquisizione delle conoscenze di base per progredire autonomamente in altre discipline chimico-biologiche.

Modulo Enzyme mechanisms
Obiettivi Generali
Al termine del corso e al superamento dell’esame, lo studente avrà acquisito le conoscenze e competenze nelle tematiche sotto riportate. Lo studente sarà in grado di descrivere la struttura di una collezione di enzimi, rappresentativi dei principali meccanismi di reazione della chimica bio-organica e delle classi enzimatiche, utilizzando programmi di visualizzazione e analisi interattive di macromolecole biologiche. Lo studente sarà in grado di prevedere, in base alla struttura dei siti attivi degli enzimi rappresentativi, il loro meccanismo di azione e di accelerazione della velocità di reazione, utilizzando le principali metodiche di indagine cinetica sperimentali.

Obiettivi Specifici
a) conoscenza e capacità di comprensione:
attraverso le lezioni ed esercitazioni lo studente dovrà conoscere e comprendere il rapporto tra struttura e funzione delle principali classi di enzimi coinvolti nelle reazioni metaboliche della cellula; dovrà comprendere la base strutturale della accelerazione della velocità; dovrà essere in grado di accedere alle banche dati delle strutture delle macromolecole biologiche;
b) capacità di applicare conoscenza e comprensione:
lo studente sarà in grado di utilizzare i principali paradigmi teorici per interpretare i meccanismi di reazione degli enzimi, e di applicare le conoscenze acquisite per la predizione delle principali caratteristiche meccanicistiche di enzimi nuovi;
c) autonomia di giudizio:
lo studente dovrà essere in grado di descrivere in piena autonomia il meccanismo di una reazione chimica catalizzata da un enzima, evidenziandone le caratteristiche distintive e suggerendo gli esperimenti atti a dimostrarne il meccanismo;
d) abilità comunicative:
lo studente dovrà avere la capacità di presentare e spiegare i meccanismi di azione degli enzimi, basati sul rapporto struttura-funzione determinato sperimentalmente, ed utilizzando correttamente e con rigore il linguaggio scientifico e tecnico;
e) capacità di apprendimento:
lo studente sarà in grado di esaminare in senso critico gli argomenti di corso, di proporre strategie sperimentali nuove ed indipendenti ove possibile, di aggiornarsi tramite la consultazione delle banche dati bibliografiche e strutturali (es. PubMed e RCSB Protein Data Bank).

Gli studenti dovranno possedere le conoscenze di base della chimica generale e organica. Conoscere i diversi tipi di legame chimico e saper ricavare l'ibridazione degli elementi chimici nelle diverse molecole. Sapere cosa è la risonanza. Sapere la definizione di un acido e una base e come si fa a definirne la forza. Conoscere le principali forze intermolecolari. Conoscere il concetto di nucleofilo ed elettrifilo. Avere una conoscenza di base dei principali gruppi funzionali in chimica organica e delle principali classi di biomolecole.
In aggiunta ai prerequisiti del modulo Bioorganic Reaction Mechanisms, gli Studenti dovranno possedere le conoscenze di base sulla struttura delle proteine: strutture primaria, secondaria, terziaria e quaternaria delle proteine e le corrispondenti metodologie di studio; l’equazione di Michaelis-Menten con e senza inibitori reversibili; le vitamine e i principali cofattori enzimatici.

Modulo: ENZYME CATALYSIS
PARTE 1) Introduzione alla catalisi enzimatica

Generalità sugli enzimi e sulle reazioni catalizzate dagli enzimi (6 ore)
Cenni storici sull’enzimologia. Teoria dello stato di transizione. Meccanismi di catalisi enzimatica. Anticorpi catalitici. Proprietà del sito attivo. Nomenclatura degli enzimi. Fondamenti di cinetica chimica. Cinetica allo stato stazionario. Equazione di Michaelis-Menten. Inibizione enzimatica: inibizione competitiva, incompetitiva e mista, equazioni, grafici e parametri cinetici. Dipendenza dell’attività enzimatica dal pH. Misura delle cinetiche rapide. Metodi: la spettroscopia stopped-flow e T-jump. La Protein Data Bank e programmi di grafica e visualizzazione delle macromolecole (Pymol). Interpretazione della struttura ai fini del meccanismo di reazione.

La logica Biochimica (2 ore)
Meccanismo delle 6 più comuni reazioni biochimiche: 1) sostituzioni nucleofile alchiliche; 2) sostituzioni nucleofile aciliche; 3) addizioni nucleofile; 4) eliminazioni; 5) addizioni elettrofile 6) reazioni redox.

PARTE 2) Rapporti struttura-funzione di alcuni enzimi rappresentativi delle principali classe di reazione organiche.

Sostituzioni nucleofile alchiliche (4 ore)
Esempi biochimici di meccanismo SN1. La geraniolo sintasi: reazione catalizzata. Esempi biochimici di meccanismo SN2: La feniletanolamina N-metil tranferasi (PNMT). Reazione catalizzata. Catecolamine. Produzione della SAM nel metabolismo. Substrati e analoghi di substrato. Caratterizzazione cinetica di forme mutanti dell’enzima. Strutture cristallografiche dell’enzima in complesso con vari ligandi. Meccanismo catalitico della PNMT. Design di analoghi dello stato di transizione della reazione catalizzata dalla PNMT. Caratterizzazione cinetica di analoghi di substrato e dello stato di transizione, con forme WT e mutanti dell’enzima. Caratterizzazione cristallografica. Misura del legame tramite Isothermal Titration Calorimetry. Cooperatività negativa. Altri esempi di inibitori analoghi dello stato di transizione: prolina racemasi e proteasi dell’HIV.

Sostituzioni nucleofile aciliche, meccanismo e reattività dei substrati (4 ore)
Confronto con le sostituzioni nucleofile aciliche. Le proteasi a serina. Specificità di substrato. Meccanismo di reazione. Organofosfati. Acetilcolinesterasi. Meccanismo catalitico. Studi sul meccanismo: mutagenesi, inibitore della proteasi, X-ray snapshots. Lipasi pancreatica e colipasi. Strutture cristallografiche. Meccanismo catalitico e attivazione della lipasi.

Addizioni nucleofile, meccanismo e reattività dei substrati (2 ore).
Meccanismo delle deidrogenasi. Gli enzimi PLP-dipendenti, ruolo del PLP nella catalisi e meccanismo stereochimico. Le aminotrasferasi. Zuccheri: formazione di emiacetali e acetali. Aldolasi, struttura, meccanismo catalitico e stereoselettività. Lisozima, struttura cristallografica, natura dei substrati e, subsiti di legame e specificità di substrato. Meccanismo catalitico e studi tramite spettrometria di massa e cristallografia.

Alfa-beta Eliminazioni (2 ore)
Enolasi: struttura, ruolo degli ioni metallici e del magnesio nel legame del substrato e nella catalisi. Inibizione da fluoruro e fosfato. Studio del meccanismo catalitico tramite misure del Kinetic Isotope Effect. Squalene. Vibrational Zero Point Energy. Spettroscopia negli infrarossi. Dettagli del meccanismo catalitico. Addizioni elettrofile. La squalene epossidasi (SQLE) e la biosintesi dello squalene. Paramagnetismo dell’ossigeno. Meccanismo della SQLE.

Utilizzo di MatLab per l’analisi dei dati di cinetica enzimatica (4 ore)
Installazione del programma e dell’App “curve fitting”. Creazione di matrici e inserimento dei dati da un file Excel. Creazione di grafici. Analisi dei dati tramite l’App “Curve fitting”: scrittura dell’equazione di Michaelis-Menten e interpretazione dei risultati. Esercitazione con dati sperimentali di cinetica stato stazionario. Reazione catalizzata dalla beta-galattosidasi con l’analogo ONPG. Analisi con equazione di Michels-Menten utilizzando MatLab. Determinazione dei parametri cinetici. Inibizione della beta-galattosidasi da parte dell’IPTG. Determinazione dei valori di Vmax e Km apparenti e della costante di inibizione (Ki).



Modulo: BIOORGANIC REACTION MECHANISMS
Introduzione:
Panoramica sui composti organici e i diversi gruppi funzionali; gruppi funzionali presenti nelle biomolecole. Classi di biomolecole e loro principali reattività; meccanismi delle reazioni organica: principi generali. Coordinate di reazione, energia di attivazione, catalizzatori e loro ruolo nel meccanismo di reazione.
Reazioni organiche e meccanismi biochimici:
Addizione elettrofila - epossidazione di alcheni - squalene epossidasi;
Sostituzioni nucleofile - carbocationi nelle SN1; reazioni SN2 - IPP isomerasi; SAM nella metiltransferasi;
Eliminazioni - -eliminazione - enolasi nella biosintesi del fosfoenolpiruvato;
Sostituzione nucleofila acilica - formazione e idrolisi di esteri e ammidi - Lipasi pancreatica; chimotripsina;
Addizione nucleofila al carbonile - formazione e reattività delle immine, formazione di acetali, condensazione aldolica - enzimi PLP-dipendenti, saccarosio sintasi, aldolasi di tipo I e II
Ossidazioni e riduzioni - idruri metallici, ozonolisi - -cheto tioestere riduttasi, -carotene diossigenasi nella biosintesi della vit. A
Decarbossilazione - decarbossilazione nella sintesi malonica - azione della TPP nella decarbossilazione del piruvato

Modulo: ENZYME CATALYSIS
- Organic Chemistry of Biological Pathways is a textbook by John E. McMurry and Tadhg P. Begley, published by Roberts & Company Publishers.
- Diapositive delle lezioni disponibile tramite la piattaforma ELearning al seguente link:
https://elearning.uniroma1.it/course/view.php?id=13895



Modulo: BIOORGANIC REACTION MECHANISMS
Chimica bio-organica; McMurry, Begley; Zanichelli (versione italiana, versione inglese del testo specificata nella sezione in inglese della pagina)

Modulo: ENZYME CATALYSIS
La bibliografia di riferimento (cartella Scientific articles) e il materiale didattico sulle esercitazioni con MatLab (cartella Matlab analyses) sono forniti dal docente tramite la piattaforma ELearning al seguente link:
https://elearning.uniroma1.it/course/view.php?id=13895



Modulo: BIOORGANIC REACTION MECHANISMS
N/D

Il corso prevede 6 CFU di lezioni frontali

Frequenza non obbligatoria

La valutazione dello studente consisterà in una prova orale sugli argomenti trattati a lezione in entrambi i moduli del corso

Definizione della possibile reattività di due molecole date allo studente
Descrizione del possibile meccanismo di reazione
Discussione sulla cinetica della reazione
Discussione di come gli enzimi possono catalizzare la stessa reazione
Confronto tra l'approccio chimico organico e quello biochimico
Descrizione della cinetica enzimatica
Descrizione di come il meccanismo enzimatico è stato studiato e dimostrato

Modulo: ENZYME CATALYSIS

• Generalità sugli enzimi e sulle reazioni catalizzate dagli enzimi (6 ore)


• La logica Biochimica (2 ore)


• Sostituzioni nucleofile alchiliche (4 ore)


• Sostituzioni nucleofile aciliche, meccanismo e reattività dei substrati (4 ore)


• Addizioni nucleofile, meccanismo e reattività dei substrati (2 ore)


• Alfa-beta Eliminazioni (2 ore)


• Utilizzo di MatLab per l’analisi dei dati di cinetica enzimatica (4 ore)

• Introduzione - 3 ore -Panoramica sui composti organici e i diversi gruppi funzionali; gruppi funzionali presenti nelle biomolecole. Classi di biomolecole e loro principali reattività; meccanismi delle reazioni organica: principi generali. Coordinate di reazione, energia di attivazione, catalizzatori e loro ruolo nel meccanismo di reazione.


• Addizione elettrofila - epossidazione di alcheni - 3 ore


• Sostituzioni nucleofile - carbocationi nelle SN1; reazioni SN2 - 2 ore


• Eliminazioni - beta-eliminazione - 2 ore


• Addizione nucleofila al carbonile - formazione e reattività delle immine, formazione di acetali, condensazione aldolica - 5 ore


• Sostituzione nucleofila acilica - formazione e idrolisi di esteri e ammidi - 2 ore


• Ossidazioni e riduzioni - idruri metallici, ozonolisi - 3 ore


• Decarbossilazione - decarbossilazione nella sintesi malonic - 1 ora


• Esempi di meccanismi di interesse biologico con particolare attenzione ai meccanismi molecolari. PLP nelle transaminasi. Citrato sintasi nel ciclo di Krebbs. Meccanismo dell'elongasi (esempio di aldolica, decarbossilazione,  riduzione, eliminazione, Reazione mediante carbeni N-eterociclici, Umpolung. Reazioni catalizzate da tiamina pirofosfato. Piruvato decarbossilasi. Alfa-chetoglutarato deidrogenasi.). - 3 ore