Biochemistry – Biochimica

Tipologia

Discipline biotecnologiche comuni

SSD

BIO/10

Anno

1º anno

Semestre

2º semestre

CFU

6

Distribuzione delle ore

24 classroom hours, 36 laboratory hours

Docenti

MARTINO LUIGI DI SALVO

Tipologia

Discipline biotecnologiche comuni

SSD

BIO/11

Anno

1º anno

Semestre

2º semestre

CFU

3

Distribuzione delle ore

8 classroom hours, 24 laboratory hours

Docenti

STEFANO CACCHIONE

Il corso si articola in due moduli: "Molecular Biology Techniques" (3 CFU) e "Protein Purification and Characterization" (6 CFU). Al termine del corso e dopo il superamento dell’esame, lo studente avrà acquisito le conoscenze e competenze riportate per ogni singolo modulo. In generale sarà in grado di spiegare i principi e le applicazioni delle più comuni metodologie biochimiche e di impostare un esperimento partendo dalla consultazione della letteratura fino all’esecuzione sul bancone del laboratorio. Sulla base delle conoscenze acquisite, lo studente avrà la capacità di interpretare e spiegare i risultati degli esperimenti biochimici attraverso l’interpretazione e la discussione dei risultati sperimentali. Le capacità critiche e di giudizio degli studenti saranno sviluppate grazie a numerose esercitazioni in classe in cui saranno svolti esercizi numerici e di ricerca in banche dati, e numerose esperienze pratiche di laboratorio (a partire dal clonaggio di frammenti di DNA prodotti per PCR fino alla purificazione e alla caratterizzazione di proteine con attività enzimatica). Le capacità di comunicazione saranno esercitate durante le lezioni teoriche e pratiche, che prevedono momenti di discussione aperta.
In futuro lo studente potrà contare sulle conoscenze e competenze acquisite per il lavoro in laboratori di analisi e di ricerca.
Gli obiettivi generali e gli obiettivi specifici dei moduli sono illustrati in dettaglio negli obiettivi formativi dei singoli moduli.

Al termine del corso, lo studente sarà in grado di:

Conoscenze e comprensione:
Comprendere i principi teorici e metodologici delle principali tecniche di biologia molecolare e biochimica applicate in laboratorio.
Conoscere i protocolli e le strategie per il clonaggio genico, la manipolazione di DNA e RNA e l’espressione di proteine ricombinanti.
Comprendere le metodologie di purificazione e caratterizzazione di proteine, inclusi approcci biochimici e biofisici.

Capacità pratiche e operative:
Applicare correttamente tecniche di laboratorio per la clonazione di geni, la preparazione di vettori di espressione e la mutagenesi sito-specifica.
Eseguire la purificazione di proteine ricombinanti mediante metodi cromatografici e analisi della loro concentrazione e attività enzimatica.
Condurre esperimenti in maniera autonoma o in piccoli gruppi, mantenendo un registro accurato delle procedure e dei risultati.

Competenze trasversali:
Analizzare, interpretare e discutere i dati sperimentali in forma scritta e orale.
Collaborare efficacemente in team durante le attività di laboratorio.
Valutare criticamente i protocolli sperimentali e proporre modifiche basate sui risultati ottenuti.
Comunicare i risultati scientifici in modo chiaro, organizzato e coerente, sia attraverso relazioni di laboratorio sia attraverso presentazioni orali.

Autonomia di giudizio e capacità di apprendimento continuo:
Sviluppare la capacità di progettare esperimenti indipendenti, integrando conoscenze teoriche e competenze pratiche.
Saper consultare e utilizzare banche dati e risorse bioinformatiche per supportare la ricerca sperimentale.

Gli studenti e le studentesse che affrontano questo corso deve possedere conoscenze di base di biochimica e biologia molecolare, sia teoriche che metodologiche

Modulo: PROTEIN PURIFICATION AND CHARACTERIZATION
Il corso è composto di due moduli integrati (Molecular Biology Techniques and Protein Purification and Characterization). Il programma del corso è da considerarsi unico.
Il corso si articolerà in due parti, una teorica e una sperimentale. La prima parte, che si terrà in aula con lezioni frontali sarà dedicata allo studio delle principali metodologie e tecniche utilizzate nei laboratori di biochimica e biologia molecolare. Nella seconda parte, che si terrà in laboratori didattici, verranno svolti esperimenti che riguardano gli argomenti trattati a lezione.

Argomenti delle lezioni:
• Approccio generale alla ricerca biochimica. La filosofia dell’esperimento. Metodo scientifico induttivo e deduttivo. Approccio top-down e bottom-up. Metodo riduzionistico vs. olistico. La scelta degli approcci
sperimentali, il setup dell’esperimento.
• I sistemi tampone. Le soluzioni. Le diluizioni.
• Modelli in vivo e in vitro. I controlli positivi e negativi. Saggi e dosaggi. Le curve standard.
• Accuratezza e precisione. Gli errori sperimentali e gli sbagli. La statistica e le indeterminazioni. Tecniche analitiche vs. tecniche preparative.
• Colture cellulari batteriche e eucariotiche.
• Metodologie del DNA ricombinante. Disegno dei primer, PCR, restrizioni, ligazioni, trasformazione di cellule competenti.
• Estrazione di DNA plasmidico da colture batteriche. Estrazione di DNA genomico.
• Estrazione di RNA. Retrotrascrizione di RNA in DNA (cDNA). Analisi dei livelli di trascrizione.
• Gene editing mediante la tecnica CRISPR/Cas9.
• Biomarker. Southern, Northern, Western blot. Real time-PCR.
• Immunochimica. Saggi ELISA e immunoistochimici.
• Metodologie per l'espressione di proteine ricombinanti.
• Frazionamento cellulare e purificazione delle macromolecole.
• Tecniche di centrifugazione e metodi basati sulla solubilità.
• Tecniche cromatografiche. Tecniche elettroforetiche.
• Cinetica enzimatica. Saggi enzimatici. Applicazione delle tecniche enzimatiche.
• Struttura e caratterizzazione delle proteine. Interazione tra macromolecole. Legame proteina-ligando.
• Tecniche spettrofotometriche, dicroismo circolare e calorimetria. Misurazione della costante di dissociazione.
• Cristallizzazione di proteine e cristallografia.
• Uso di internet nella ricerca biochimica.

Argomenti delle esercitazioni: gli argomenti delle esercitazioni potranno variare leggermente dallo schema riportato in seguito a seconda dell’esito dei vari esperimenti.
• Uso di internet nella ricerca biochimica.
• Clonaggio di cDNA in vettori di espressione.
• Purificazione di proteine ricombinanti.
• Caratterizzazione di una proteina purificata dal punto di vista strutturale e funzionale.
• Targeting genico mediante CRISPR/Cas9 (progettazione dei costrutti mediante software online; preparazione dei costrutti e clonaggio direzionale in vettori; analisi dei vettori ricombinanti)

Le esercitazioni di laboratorio sono da considerarsi obbligatorie



Modulo: MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUES
Il corso è composto di due moduli integrati (Molecular Biology Techniques and Protein Purification and Characterization). Il programma del corso è da considerarsi unico.
Il corso si articolerà in due parti, una teorica e una sperimentale. La prima parte, che si terrà in aula con lezioni frontali sarà dedicata allo studio delle principali metodologie e tecniche utilizzate nei laboratori di biochimica e biologia molecolare. Nella seconda parte, che si terrà in laboratori didattici, verranno svolti esperimenti che riguardano gli argomenti trattati a lezione.

Argomenti delle lezioni:
• Approccio generale alla ricerca biochimica. La filosofia dell’esperimento. Metodo scientifico induttivo e deduttivo. Approccio top-down e bottom-up. Metodo riduzionistico vs. olistico. La scelta degli approcci sperimentali, il setup dell’esperimento.
• I sistemi tampone. Le soluzioni. Le diluizioni.
• Modelli in vivo e in vitro. I controlli positivi e negativi. Saggi e dosaggi. Le curve standard.
• Accuratezza e precisione. Gli errori sperimentali e gli sbagli. La statistica e le indeterminazioni. Tecniche analitiche vs. tecniche preparative.
• Colture cellulari batteriche e eucariotiche.
• Metodologie del DNA ricombinante. Disegno dei primer, PCR, restrizioni, ligazioni, trasformazione di cellule competenti.
• Estrazione di DNA plasmidico da colture batteriche. Estrazione di DNA genomico.
• Estrazione di RNA. Retrotrascrizione di RNA in DNA (cDNA). Analisi dei livelli di trascrizione.
• Gene editing mediante la tecnica CRISPR/Cas9.
• Biomarker. Southern, Northern, Western blot. Real time-PCR.
• Immunochimica. Saggi ELISA e immunoistochimici.
• Metodologie per l'espressione di proteine ricombinanti.
• Frazionamento cellulare e purificazione delle macromolecole.
• Tecniche di centrifugazione e metodi basati sulla solubilità.
• Tecniche cromatografiche. Tecniche elettroforetiche.
• Cinetica enzimatica. Saggi enzimatici. Applicazione delle tecniche enzimatiche.
• Struttura e caratterizzazione delle proteine. Interazione tra macromolecole. Legame proteina-ligando.
• Tecniche spettrofotometriche, dicroismo circolare e calorimetria. Misurazione della costante di dissociazione.
• Cristallizzazione di proteine e cristallografia.
• Uso di internet nella ricerca biochimica.

Argomenti delle esercitazioni: gli argomenti delle esercitazioni potranno variare leggermente dallo schema riportato in seguito a seconda dell’esito dei vari esperimenti.
• Uso di internet nella ricerca biochimica.
• Clonaggio di cDNA in vettori di espressione.
• Purificazione di proteine ricombinanti.
• Caratterizzazione di una proteina purificata dal punto di vista strutturale e funzionale.
• Targeting genico mediante CRISPR/Cas9 (progettazione dei costrutti mediante software online; preparazione dei costrutti e clonaggio direzionale in vettori; analisi dei vettori ricombinanti)

Le esercitazioni di laboratorio sono da considerarsi obbligatorie

Modulo: PROTEIN PURIFICATION AND CHARACTERIZATION
• Un testo di Biochimica generale (e.g. Voet&Voet, Leningher, Stryer) e uno di Biologia Molecolare (e.g. Watson, Lewin) dovrebbero essere a disposizione per necessità di consultazione.
• Analytical Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, by Rajan Katoch - ISBN 978-1-4419-9784-5, e-ISBN 978-1-4419-9785-2, DOI 10.1007/978-1-4419-9785-2 – Springer.
• Biochemical Methods: A Concise Guide for Students and Researchers, by Alfred Pingoud, Claus Urbanke, Jim Hoggett, Albert Jeltsch – Wiley. ISBN: 978-3-527-30299-4, October 2002, 374 Pages.
• Biochemical Calculations: How to Solve Mathematical Problems in General Biochemistry, by Irwin H. Segel - Editore : Wiley, 458 pagine, ISBN-10 : 9788126526437.
• Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, 8th Edition, by T. A. Brown – Editore: Wiley-Blackwell, 432 pagine, ISBN: 978-1-119-64067-7
• Lezioni su PowerPoint disponibili – Dispense e appunti di laboratorio.
• Gli studenti, suddivisi in piccoli gruppi di lavoro, saranno responsabilizzati nel tenere aggiornato un quaderno di laboratorio con tutte gli esperimenti che verranno svolti, in cui saranno annotate le tecniche, il design
degli esperimenti, i dati e la discussione dei risultati.




Modulo: MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUES
• Un testo di Biochimica generale (e.g. Voet&Voet, Leningher, Stryer) e uno di Biologia Molecolare (e.g. Watson, Lewin) dovrebbero essere a disposizione per necessità di consultazione.
• Analytical Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, by Rajan Katoch - ISBN 978-1-4419-9784-5, e-ISBN 978-1-4419-9785-2, DOI 10.1007/978-1-4419-9785-2 – Springer.
• Biochemical Methods: A Concise Guide for Students and Researchers, by Alfred Pingoud, Claus Urbanke, Jim Hoggett, Albert Jeltsch – Wiley. ISBN: 978-3-527-30299-4, October 2002, 374 Pages.
• Biochemical Calculations: How to Solve Mathematical Problems in General Biochemistry, by Irwin H. Segel - Editore : Wiley, 458 pagine, ISBN-10 : 9788126526437.
• Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, 8th Edition, by T. A. Brown – Editore: Wiley-Blackwell, 432 pagine, ISBN: 978-1-119-64067-7
• Lezioni su PowerPoint disponibili – Dispense e appunti di laboratorio.
• Gli studenti, suddivisi in piccoli gruppi di lavoro, saranno responsabilizzati nel tenere aggiornato un quaderno di laboratorio con tutte gli esperimenti che verranno svolti, in cui saranno annotate le tecniche, il design degli esperimenti, i dati e la discussione dei risultati.

Modulo: PROTEIN PURIFICATION AND CHARACTERIZATION
N/D
Modulo: MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUES
N/D

Il corso sarà suddiviso in due parti: una sezione teorica e una sezione sperimentale. La prima parte, che si svolgerà in aula con lezioni teoriche, sarà dedicata allo studio delle principali metodologie e tecniche utilizzate nei laboratori di biochimica e biologia molecolare. Nella seconda parte, che si svolgerà in un laboratorio dedicato, verranno eseguiti esperimenti relativi agli argomenti trattati in aula.

Le esperienze di laboratorio possono variare leggermente rispetto allo schema riportato di seguito, a seconda dei risultati sperimentali, ma si concentreranno sui seguenti argomenti:
- Utilizzo di Internet nella ricerca biochimica
- Clonaggio di cDNA in vettori di espressione
- Gene targeting mediante CRISPR/Cas9 (progettazione dei costrutti tramite software online; preparazione dei costrutti e clonaggio direzionale nei vettori; analisi dei vettori ricombinanti
- Purificazione di proteine ricombinanti
- Caratterizzazione strutturale e funzionale di una proteina purificata

Frequenza facoltativa ma fortemente consigliata, soprattutto per quando riguarda le esercitazioni pratiche

Modalità d’esame:
Durante il corso, gli studenti e le studentesse saranno suddivisi in gruppi di 3–4 persone. Ogni gruppo lavorerà insieme durante tutte le sessioni di laboratorio e dovrà mantenere un registro di laboratorio con tutte le esperienze effettuate. Al termine delle attività di laboratorio, ogni gruppo dovrà redigere un relazione di laboratorio in cui gli esperimenti saranno descritti, analizzati e discussi. La relazione dovrà essere consegnata ai docenti una settimana prima dell’esame. L’esame finale comprenderà la discussione di questa relazione.

Inoltre, l’esame sarà composto da altre due parti: scritta e orale.

Prova scritta:
- Esercizi su progettazione di primer per PCR, clonaggio, digestione con enzimi di restrizione e analisi su gel di agarosi
- Esercizi su preparazione di soluzioni e diluizioni
- Esercizi sulla misurazione di concentrazioni mediante spettrofotometria
- Domande a scelta multipla su argomenti vari

Prova orale:
- Breve presentazione (2–3 diapositive) su un argomento trattato durante le esperienze di laboratorio (ad esempio, una metodologia)
- La presentazione sarà seguita da domande relative all’argomento trattato, che potranno riguardare anche l’intero programma del corso

Prova scritta:
- Esercizi su progettazione di primer per PCR, clonaggio, digestione con enzimi di restrizione e analisi su gel di agarosio
- Esercizi su preparazione di soluzioni e diluizioni
- Esercizi sulla misurazione di concentrazioni mediante spettrofotometria
- Domande a scelta multipla su argomenti vari

Prova orale:
- Breve presentazione (2–3 diapositive) su un argomento trattato durante le esperienze di laboratorio (ad esempio, una metodologia)
- La presentazione sarà seguita da domande relative all’argomento trattato, che potranno riguardare anche l’intero programma del corso e la relazione di laboratorio

Modulo: PROTEIN PURIFICATION AND CHARACTERIZATION

• Regole di sicurezza in laboratorio
  • Testi di riferimento: Diapositive. Materiale sulla sicurezza in laboratorio dal sito del Dipartimento di Scienze biochimiche


• Ricerca in banche dati, allineamento di sequenze. Clonaggio in vettori di espressione, mutagenesi sito-specifica
  • Testi di riferimento: Relativi capitoli dei testi consigliati. Dispense a lezione


• Purificazione delle proteine: frazionamento con solfato d'ammonio; dialisi; preparazione dei tamponi e equilibratione della colonna; cromatografia
  • Testi di riferimento: Relativi capitoli dei testi consigliati. Dispense a lezione


• Raccolta e concentrazione delle frazioni. Analisi delle proteine: saggio di Bradford, SDS-PAGE e saggio enzimatico. Tabella di purificazione
  • Testi di riferimento: Relativi capitoli dei testi consigliati. Dispense a lezione


• Cristallografia delle proteine. Prove di cristallizzazione
  • Testi di riferimento: Relativi capitoli dei testi consigliati. Dispense a lezione


• Metodi biofisici per le interazioni proteina-proteina. Esercizi sulle interazioni proteina-proteina
  • Testi di riferimento: Relativi capitoli dei testi consigliati. Dispense a lezione


• Biologia sintetica e Xenobiologia
  • Testi di riferimento:  Dispense a lezione. Referenze a lavori scientifici

• DNA ricombinante, plasmidi, enzimi di restrizione, elettroforesi su gel
  • Testi di riferimento: Relativi capitoli dei testi consigliati. Dispense a lezione


• Purificazione di  DNA plasmidico, gel di agarosio, spettrofotometria,, PCR, enzimi di modificazione
  • Testi di riferimento: Relativi capitoli dei testi consigliati. Dispense a lezione


• Southern, Northern e Western Blots. Sequenziamento del DNA: Maxam & Gilbert, Sanger sequencing method, Next Generation Sequencing
  • Testi di riferimento: Relativi capitoli dei testi consigliati. Dispense a lezione


• Gene editing, CRISPR/Cas9
  • Testi di riferimento: Relativi capitoli dei testi consigliati. Dispense a lezione


• Purificazione di  DNA plasmidico, digestione con enzimi di restrizione, preparazione di un frammento di DNA mediante PCR
  • Testi di riferimento: Protocollo della procedura sperimentale


• Ligazione di un frammento di DNA in un vettore, trasformazione di cellule competenti batteriche, PCR da colonia
  • Testi di riferimento: Protocollo della procedura sperimentale