Genetica e Biologia Molecolare - Genetics and Molecular Biology

MARIANGELA MORLANDO
MARIANGELA MORLANDO
ADRIANO SETTI
ADRIANO SETTI

L'obiettivo formativo primario è fornire una solida preparazione teorico-pratica nell'ambito della biologia dell'RNA ad alta risoluzione, consentendo agli studenti di padroneggiare le moderne tecnologie di sequenziamento e analisi dei dati omici. Questo implica sviluppare competenze critiche nell'interpretazione dei risultati sperimentali e acquisire una comprensione approfondita delle metodologie avanzate di studio dell'RNA e delle sue applicazioni come CRISPR ed epitrascrittomica. In sintesi, il corso mira a formare studenti capaci di utilizzare strumenti all'avanguardia per esplorare la complessità della biologia dell'RNA.

Dopo aver completato il corso, gli studenti avranno appreso i principi base necessari a sviluppare
approcci sperimentali ed analitici per la caratterizzazione della trascrizione e della biologia del RNA
usando metodi ad alta risoluzione, inclusi le moderne tecnologie di omica.

Un background biologico o biomedico è richiesto, incluse le conoscenze di base di biologia molecolare,
biochimica e cellulare. Dimestichezza con la lettura di riviste scientifiche in inglese è utile ma non
necessaria. Per il modulo di “Strumenti di Analisi” non è necessaria alcuna esperienza pregressa, ma
la familiarità con internet ed i sistemi base operativi (Linux, Mac OSX, Windows 10) è preferibile.

Lezioni 1-4 (Prof.ssa Morlando)
- Introduzione alla complessità del mondo dell'RNA.
- Metodi per la generazione di sistemi modello cellulari per lo studio del differenziamento cellulare e dell'organizzazione dei tessuti. Esempi di differenziamento muscolare e neuronale 2D in vitro, nonché la generazione di colture 3D (ad esempio, organoidi).
- Diverse applicazioni della tecnologia CRISPR: a) per eseguire l'editing genomico; b) per controllare in modo reversibile l'espressione genica; c) per eseguire screening genetici.


Lezioni 5-7 (Prof. Setti)
- Metodologie pratiche per la progettazione di esperimenti CRISPR-KO combinati con l'uso di RNA-sequencing per esplorare l'effetto del KO sull'espressione genica. La lezione includerà l'analisi dell'RNA-sequencing utilizzando la piattaforma Galaxy per eseguire la pre-elaborazione e l'allineamento dei file FASTQ al genoma di riferimento. Il software IGV verrà utilizzato per esplorare le delezioni o mutazioni indotte nel locus bersaglio nelle cellule attraverso l'analisi delle letture allineate. Verranno poi presentate la quantificazione dell'espressione genica, l'analisi dell'espressione differenziale e l'analisi di arricchimento dei termini GO.

Lezioni 8-9 (Prof.ssa Morlando)
- Approcci a singola cellula basati su droplet e su pozzetti.
- Trascrittomica spaziale.

Lezioni 10-12 (Prof. Setti)
- Metodi per l'analisi dei dati trascrittomici a singola cellula provenienti da diversi sistemi modello, tra cui: elaborazione dei dati, filtraggio della qualità delle cellule, riduzione della dimensionalità e clustering, metodi di integrazione di base, metodologie di espressione differenziale per identificare l'identità della popolazione cellulare o per confrontare le condizioni (ad esempio, WT vs KO), analisi della traiettoria utilizzando Monocle o RNA-velocity. Questo modulo includerà l'analisi approfondita di articoli scientifici selezionati utilizzati come riferimento (esempio di sistema di cellule immunitarie, organoidi neuro-muscolari, ecc.).
- Metodi per l'integrazione di dati multi-omici in omiche a singola cellula, come epigenoma (ATAC-seq), trascrittoma (RNA-seq) e codici a barre genomici. Analisi del pathway e calcolo del Module-score. Verranno menzionate metodologie avanzate, come il Topic modelling e l'applicazione Scenic+.

Lezione 13 (Prof. Setti)
- Indagine sulla biologia dell'RNA utilizzando strumenti web, tra cui:
i) Strumenti web utilizzati per indagare l'espressione dei geni in vari organismi, tessuti e condizioni patologiche (es. GTEX).
ii) Indagine sulle dipendenze genetiche utilizzando progetti di caratterizzazione funzionale su larga scala (es. DEPMAP) e dataset sul cancro (es. CBIO portal).
iii) Database di Trascrittomica Spaziale applicata al cervello umano.

Lezioni 14-15 (Prof.ssa Morlando)
- RNA corti (microRNA):
- Metodi di sequenziamento dell'RNA corto per studiare l'espressione dei microRNA.
- Metodi per lo studio della loro modalità d'azione e l'identificazione del bersaglio (es. CLASH).
- Metodi per inibire i miRNA espressi endogenamente o per recuperare la loro espressione persa in condizioni patologiche.
- I miRNA nei fluidi corporei: origine e utilizzo come biomarcatori; metodi per la loro rilevazione.


Lezioni 16-17 (Prof. Setti)
- Introduzione alle letture chimeriche (chimeric-reads). Spiegazione approfondita della metodologia CLASH che consente di catturare i microRNA legati, inclusi gli elementi di RNA bersaglio dei microRNA.
- Caratterizzazione delle interazioni RNA:RNA con diversi approcci basati su derivati del psoralene tra cui PARIS, SPLASH e COMRADES, approcci basati su proteine tra cui MARIO e RIC-seq o nuove frontiere come le metodologie basate sul chetosale (KARR-seq). Approccio RNA-SPRITE.

Lezioni 18 (Prof. Setti)
- Introduzione alla struttura secondaria dell'RNA.
- Analisi dei principali approcci utilizzati per sondare le strutture dell'RNA. Confronto tra SHAPE e DMA-Map-seq.

Lezioni 19-21 (Prof.ssa Morlando)
- Nuovi concetti in trascrittomica: epitrascrittomica. L'importanza dell'epitrascrittoma nel controllo dell'espressione genica e nel contribuire a diversi fenotipi di malattia.
- Metodi innovativi per catturare la sequenza/modificazione dell'RNA e la diversità del trascritto.
- Sequenziamento a lunghe letture (Long reads sequencing): Oxford Nanopore e PacBio.

Lezione 22 (Prof.ssa Morlando)
- Principi di analisi epitrascrittomica, strumenti disponibili, confronti ed esempio di workflow (es. Nanocompore).
- Sessione pratica con approccio dettagliato all'analisi dei dati da esperimenti di sequenziamento di RNA nativo.

Lezioni 23-24 (Prof. Setti)
- Introduzione alle funzioni e alle attività regolatorie delle RBP (Proteine leganti l'RNA).
- Metodologie per studiare i siti di legame delle RBP (RNAcompete, metodologie CLIP, ecc.).
- Metodologie utilizzate per studiare i siti di modificazione dell'RNA nell'RNA: esempi di meRIP-seq e mi-CLIP.

piattaforma e-learning (articoli scientifici e materiale fornito dal docente)

Salgueiro et al., 2025. Individualized patient tumor organoids faithfully preserve human brain tumor ecosystems and predict patient response to therapy . Cell. https://doi.org/10.1016/j.stem.2025.01.002
Macosko et al., 2015 Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2015.05.002
Nadalin et al., 2024 Multi-omic lineage tracing predicts the transcriptional, epigenetic and genetic determinants of cancer evolution Nature Communications https://doi.org/10.1038/s41467-024-51424-4
Cruciani & Novoa, 2026 The new era of single-molecule RNA modification detection through nanopore base-calling models. nature reviews molecular cell biology. https://doi.org/10.1038/s41580-025-00896-3
Tzec‐Interián et al., 2024 Bioinformatics perspectives on transcriptomics: A comprehensive review of bulk and single‐cell RNA sequencing analyses Quantitative Biology DOI: 10.1002/qub2.78
Cao and Kapranov 2022 Methods to Analyze the Non-Coding RNA Interactome—Recent Advances
and Challenges. Frontiers in Genetics doi: 10.3389/fgene.2022.857759
Hafner et al., 2021 CLIP and complementary methods. METhODS PRImERS https://doi.org/10.1038/s43586-021-00018-1
Ye et al., 2024 Technological advancements in deciphering RNA-RNA interactions. Molecular Cell https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.06.036

Le lezioni verranno svolte come didattica frontale mediante la presentazione di Slides che verranno in seguito rese disponibili agli studenti.
Durante le lezioni verrà stimolata la discussione sulle diverse tematiche in programma in modo da verificare lezione dopo lezione il grado di acquisizione delle tematiche trattate da parte dello studente

La frequenza non è obbigatoria ma fortemente consigliata

La modalità di valutazione consisterà in un esame orale dove lo studente è invitato a presentare un articolo scientifico di proprio interesse in cui vengano applicate una o più metodologie trattate durante il corso. Seguirà discussione e domande estese a tutti gli argomenti del programma.

Quale metodologie di sequenziamento applicheresti per lo studio dei microRNA?
Che differenza c'e' tra short e long reads sequencing?
Come si può effettuare un sequenziamento single cell?

• Argomento 1 - Introduzione alla complessità del mondo dell'RNA. (Lezione 1)
  • Testi di riferimento: Slide e materiale fornito dal docente disponibile su e-learning


• Argomento 2 - Metodi per la generazione di sistemi modello cellulari per lo studio della differenziazione cellulare e dell'organizzazione tissutale. Esempi di differenziazione muscolare e neuronale in vitro 2D(bidimensionale), nonché la generazione di colture 3D (tridimensionali) (ad esempio, organoidi). Lezioni (2-3)
  • Testi di riferimento: Slide e materiale fornito dal docente disponibile su e-learning


• Argomento 3 -Tecnologia CRISPR. Diverse applicazioni: a) per eseguire il genome editing (modifica del genoma); b) per controllare in modo reversibile l'espressione genica; c) per eseguire screening genetici. (Lezioni 3-4)
  • Testi di riferimento: Slide e materiale fornito dal docente disponibile su e-learning


• Argomento 4: Metodologie pratiche per il design di un esperimento CRISPR-KO (Knockout) combinato con l'uso del sequenziamento dell'RNA (RNA-sequencing) per esplorare l'effetto del Knockout (KO) sull'espressione genica. (Lezioni 5-7)
  • Testi di riferimento: Slide e materiale fornito dal docente disponibile su e-learning


• Argomento 5 Sequenziamento dell'RNA a singolo cellula: metodo droplet e well based (Lezione 8)
  • Testi di riferimento: Slide e materiale fornito dal docente disponibile su e-learning


• Argomento 6 Sequenziamento spaziale del trascrittoma (Lezione 9)
  • Testi di riferimento: Slide e materiale fornito dal docente disponibile su e-learning


• Argomento 7: Metodi per l'analisi dei dati di trascrittomi a singola cellula provenienti da diversi sistemi modello (Lezioni 10-12)
  • Testi di riferimento: Slide e materiale fornito dal docente disponibile su e-learning


• Argomento 8: La biologia dell'RNA mediante l'uso di web tools (lezione 13)
  • Testi di riferimento: Slide e materiale fornito dal docente disponibile su e-learning


• Argomento 9 : la biologia dei microRNA: nuovi concetti e metodi (Lezioni 14-15)
  • Testi di riferimento: Slide e materiale fornito dal docente disponibile su e-learning


• Argomento 10: Introduzione alle reads chimeriche (chimeric-reads). Spiegazione approfondita della metodologia CLASH che permette di catturare i microRNA includendo gli elementi di RNA target dei microRNA. (Lezione 16)
  • Testi di riferimento: Slide e materiale fornito dal docente disponibile su e-learning


• Argomento 11: Caratterizzazione delle interazioni RNA:RNA con diversi approcci: basati sui derivati del psoralene, basati su proteine e basate sul chetossale Lezione 17)
  • Testi di riferimento: Slide e materiale fornito dal docente disponibile su e-learning


• Argomento 12: Introduzione alla struttura secondaria dell'RNA. Analisi dei principali approcci utilizzati per sondare le strutture dell'RNA. Confronto tra SHAPE e DMS-Map-seq Lezione 18)
  • Testi di riferimento: Slide e materiale fornito dal docente disponibile su e-learning


• Argomento 13: Nuovi concetti in trascrittomica: epitrascrittomica. Metodi innovativi per catturare la Sequenza/modificazione dell'RNA e la Diversità Trascrittomica. (lezioni 19-20)
  • Testi di riferimento: Slide e materiale fornito dal docente disponibile su e-learning


• Argomento 14: - Metodologie di sequenziamento a lettura lunga (long-read sequencing): Sequenziamento Nanopore (metodologie e applicazioni); il sequenziamento tramite protocollo PacBio. Il sequenziamento nativo dell'RNA. Considerazioni pratiche e metodologie per la valutazione della qualità e l'analisi dei dati (Lezioni 21)
  • Testi di riferimento: Slide e materiale fornito dal docente disponibile su e-learning


• Argomento 15:Principi dell'analisi epitrascrittomica, strumenti disponibili, confronti ed esempio di un flusso di lavoro (ad esempio, Nanocompore).Sessione pratica con un approccio dettagliato all'analisi dei dati derivanti da esperimenti di sequenziamento nativo dell'RNA. (Lezione 22)
  • Testi di riferimento: Slide e materiale fornito dal docente disponibile su e-learning


• Argomento 16: Introduzione alle funzioni e alle attività regolatorie delle RBP. Metodologie per studiare i siti di legame delle RBP(RNAcompete, metodologie CLIP, ecc.). (Lezione 23)
  • Testi di riferimento: Slide e materiale fornito dal docente disponibile su e-learning


• Argomento 17: Metodologie utilizzate per studiare i siti di modificazione dell'RNA: esempi di meRIP-seq e mi-CLIP. (Lezione 24)
  • Testi di riferimento: Slide e materiale fornito dal docente disponibile su e-learning