Programma
Il corso è composto di due moduli integrati (Molecular Biology Techniques and Protein Purification and Characterization). Il programma del corso è da considerarsi unico.
Il corso si articolerà in due parti, una teorica e una sperimentale. La prima parte, che si terrà in aula con lezioni frontali sarà dedicata allo studio delle principali metodologie e tecniche utilizzate nei laboratori di biochimica e biologia molecolare. Nella seconda parte, che si terrà in laboratori didattici, verranno svolti esperimenti che riguardano gli argomenti trattati a lezione.
Argomenti delle lezioni:
• Approccio generale alla ricerca biochimica. La filosofia dell’esperimento. Metodo scientifico induttivo e deduttivo. Approccio top-down e bottom-up. Metodo riduzionistico vs. olistico. La scelta degli approcci sperimentali, il setup dell’esperimento.
• I sistemi tampone. Le soluzioni. Le diluizioni.
• Modelli in vivo e in vitro. I controlli positivi e negativi. Saggi e dosaggi. Le curve standard.
• Accuratezza e precisione. Gli errori sperimentali e gli sbagli. La statistica e le indeterminazioni. Tecniche analitiche vs. tecniche preparative.
• Colture cellulari batteriche e eucariotiche.
• Metodologie del DNA ricombinante. Disegno dei primer, PCR, restrizioni, ligazioni, trasformazione di cellule competenti.
• Estrazione di DNA plasmidico da colture batteriche. Estrazione di DNA genomico.
• Estrazione di RNA. Retrotrascrizione di RNA in DNA (cDNA). Analisi dei livelli di trascrizione.
• Gene editing mediante la tecnica CRISPR/Cas9.
• Biomarker. Southern, Northern, Western blot. Real time-PCR.
• Immunochimica. Saggi ELISA e immunoistochimici.
• Metodologie per l'espressione di proteine ricombinanti.
• Frazionamento cellulare e purificazione delle macromolecole.
• Tecniche di centrifugazione e metodi basati sulla solubilità.
• Tecniche cromatografiche. Tecniche elettroforetiche.
• Cinetica enzimatica. Saggi enzimatici. Applicazione delle tecniche enzimatiche.
• Struttura e caratterizzazione delle proteine. Interazione tra macromolecole. Legame proteina-ligando.
• Tecniche spettrofotometriche, dicroismo circolare e calorimetria. Misurazione della costante di dissociazione.
• Cristallizzazione di proteine e cristallografia.
• Uso di internet nella ricerca biochimica.
Argomenti delle esercitazioni: gli argomenti delle esercitazioni potranno variare leggermente dallo schema riportato in seguito a seconda dell’esito dei vari esperimenti.
• Uso di internet nella ricerca biochimica.
• Clonaggio di cDNA in vettori di espressione.
• Purificazione di proteine ricombinanti.
• Caratterizzazione di una proteina purificata dal punto di vista strutturale e funzionale.
• Targeting genico mediante CRISPR/Cas9 (progettazione dei costrutti mediante software online; preparazione dei costrutti e clonaggio direzionale in vettori; analisi dei vettori ricombinanti)
Le esercitazioni di laboratorio sono da considerarsi obbligatorie
Prerequisiti
1) INDISPENSABILE: aver seguito i corsi di Bioorganic Chemistry (I semestre) e Structure and Function of Macromolecules (I semestre); lo studente dovrebbe aver inoltre superato i relativi esami di profitto;
2) INDISPENSABILE: disponibilità alla frequenza delle esercitazioni pratiche di laboratorio e predisposizione al lavoro in gruppo;
3) INDISPENSABILE: conoscenza dei concetti di base della biochimica e della biologia molecolare e cellulare. In particolare, è necessario conoscere: a) concetti e proprietà delle soluzioni tampone, teoria delle soluzioni e calcolo stechiometrico per la loro preparazione; b) concetti base della fisiologia cellulare e delle tecniche di coltura cellulare; c) caratteristiche strutturali e funzionali del DNA, con particolare riguardo ai vettori plasmidici utilizzati nelle tecniche del DNA ricombinante; d) caratteristiche strutturali e funzionali delle proteine con particolare attenzione agli enzimi;
3) IMPORTANTE: conoscenza delle tecnologie di base usate in biologia molecolare e in biochimica, tra cui le metodologie del DNA ricombinante, la cromatografia, l’elettroforesi e i saggi enzimatici;
4) IMPORTANTE: conoscenza di base delle banche dati per la ricerca di letteratura scientifica, sequenze proteiche e nucleotidiche.
Testi di riferimento
• Un testo di Biochimica generale (e.g. Voet&Voet, Leningher, Stryer) e uno di Biologia Molecolare (e.g. Watson, Lewin) dovrebbero essere a disposizione per necessità di consultazione.
• Analytical Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, by Rajan Katoch - ISBN 978-1-4419-9784-5, e-ISBN 978-1-4419-9785-2, DOI 10.1007/978-1-4419-9785-2 – Springer.
• Biochemical Methods: A Concise Guide for Students and Researchers, by Alfred Pingoud, Claus Urbanke, Jim Hoggett, Albert Jeltsch – Wiley. ISBN: 978-3-527-30299-4, October 2002, 374 Pages.
• Biochemical Calculations: How to Solve Mathematical Problems in General Biochemistry, by Irwin H. Segel - Editore : Wiley, 458 pagine, ISBN-10 : 9788126526437.
• Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, 8th Edition, by T. A. Brown – Editore: Wiley-Blackwell, 432 pagine, ISBN: 978-1-119-64067-7
• Lezioni su PowerPoint disponibili – Dispense e appunti di laboratorio.
• Gli studenti, suddivisi in piccoli gruppi di lavoro, saranno responsabilizzati nel tenere aggiornato un quaderno di laboratorio con tutte gli esperimenti che verranno svolti, in cui saranno annotate le tecniche, il design degli esperimenti, i dati e la discussione dei risultati.
Modalità insegnamento
Il corso è composto di due moduli integrati (Molecular Biology Techniques and Protein Purification and Characterization). La modalità di svolgimento del corso è da considerarsi unica.
Il corso sarà svolto tramite lezioni frontali teoriche (32 ore), esercitazioni teoriche in classe (12 ore) ed esperienze pratiche di laboratorio (48 ore).
Lezioni frontali (32 ore):
• Spiegazione degli argomenti oggetto del programma tramite proiezione di diapositive e materiale audiovisivo. Questo modello didattico è volto a fornire la conoscenza teorica delle metodologie biochimiche.
• Discussioni aperte degli argomenti trattati a lezione, durante le quali gli studenti sono chiamati a intervenire, con lo scopo di sviluppare le capacità di comunicazione, critica e giudizio.
Esercitazioni teoriche in classe (12 ore):
• 1) Esercizi di stechiometria sulla preparazione delle soluzioni tampone e la diluizione dei campioni (2 ore). Particolare attenzione verrà posta alla comprensione dell’importanza delle soluzioni tampone e alla preparazioni delle soluzioni in generale
• 2) Esercizi sull’acquisizione di sequenze nucleotidiche e proteiche dalle banche dati (4 ore)
• 3) Esercizi sulle strategie di clonaggi di frammenti di cDNA (4 ore)
• 4) compilazione di una tabella di purificazione (2 ore)
Esperienze di laboratorio (48 ore):
• Purificazione di DNA plasmidico, digestione con enzimi di restrizione e controllo analitico su gel (4 ore)
• Preparazione dei terreni di crescita e di cellule batteriche competenti per la trasformazione (4 ore)
• Digestione dei vettori per CRISPR/Cas9 e verifica su gel di agarosio (3 ore)
• Preparazione dei costrutti mediante appaiamento di oligonucleotidi e fosforilazione enzimatica dell’estremità 5’ (3 ore)
• Ligazione dei costrutti al vettore, trasformazione di batteri competenti (4 ore)
• Analisi dei cloni ricombinanti mediante PCR e separazione su gel di agarosio (5 ore)
• Preparazione del DNA del vettore dai cloni positivi (5 ore)
• Crescita batterica, espressione e purificazione di una proteina ricombinante e analisi su SDS-PAGE (8 ore)
• Determinazione della concentrazione proteica in soluzione e set up di una piastra di cristallizzazione (3 ore)
• Misure di cinetica enzimatica (4 ore)
• Preparazione di una forma apo di un enzima (3 ore)
• Misura della costante di dissociazione proteina-ligando (2 ore)
Le esperienze di laboratorio, che sono obbligatorie, hanno lo scopo di mettere in pratica i concetti teorici studiati a lezione, sviluppare la capacità di pianificare un esperimento e interpretarlo, accrescere le capacità critiche e di giudizio.
Frequenza
Lezioni in aula ed esercitazioni in laboratorio
Modalità di esame
Il corso è composto di due moduli integrati (Molecular Biology Techniques and Protein Purification and Characterization). La prova d’esame è da considerarsi unica.
L'esame prevede un compito scritto composto di 4-5 esercizi che rispecchiano gli argomenti trattati durante le lezioni e le esercitazioni. Seguirà una prova orale che verterà sulla discussione del compito scritto e approfondirà gli argomenti relativi alle esperienze di laboratorio. Parte integrante della valutazione saranno alcune verifiche durante le prove pratiche di laboratorio. Esercizi analoghi a quelli del compito scritto verranno svolti a fine corso in classe insieme agli studenti.
In generale, la preparazione dello studente sarà valutata in base alla sua capacità di descrivere gli esperimenti effettuati e le relative metodologie utilizzate in modo chiaro e scientificamente rigoroso e di saper collegare i vari argomenti, dimostrando di aver compreso la logica metodologica. Ai fini della valutazione complessiva della preparazione dello studente, saranno prese in considerazione anche le capacità di comunicazione, critica e giudizio.
Modalità di erogazione
Il corso è composto di due moduli integrati (Molecular Biology Techniques and Protein Purification and Characterization). La modalità di svolgimento del corso è da considerarsi unica.
Il corso sarà svolto tramite lezioni frontali teoriche (32 ore), esercitazioni teoriche in classe (12 ore) ed esperienze pratiche di laboratorio (48 ore).
Lezioni frontali (32 ore):
• Spiegazione degli argomenti oggetto del programma tramite proiezione di diapositive e materiale audiovisivo. Questo modello didattico è volto a fornire la conoscenza teorica delle metodologie biochimiche.
• Discussioni aperte degli argomenti trattati a lezione, durante le quali gli studenti sono chiamati a intervenire, con lo scopo di sviluppare le capacità di comunicazione, critica e giudizio.
Esercitazioni teoriche in classe (12 ore):
• 1) Esercizi di stechiometria sulla preparazione delle soluzioni tampone e la diluizione dei campioni (2 ore). Particolare attenzione verrà posta alla comprensione dell’importanza delle soluzioni tampone e alla preparazioni delle soluzioni in generale
• 2) Esercizi sull’acquisizione di sequenze nucleotidiche e proteiche dalle banche dati (4 ore)
• 3) Esercizi sulle strategie di clonaggi di frammenti di cDNA (4 ore)
• 4) compilazione di una tabella di purificazione (2 ore)
Esperienze di laboratorio (48 ore):
• Purificazione di DNA plasmidico, digestione con enzimi di restrizione e controllo analitico su gel (4 ore)
• Preparazione dei terreni di crescita e di cellule batteriche competenti per la trasformazione (4 ore)
• Digestione dei vettori per CRISPR/Cas9 e verifica su gel di agarosio (3 ore)
• Preparazione dei costrutti mediante appaiamento di oligonucleotidi e fosforilazione enzimatica dell’estremità 5’ (3 ore)
• Ligazione dei costrutti al vettore, trasformazione di batteri competenti (4 ore)
• Analisi dei cloni ricombinanti mediante PCR e separazione su gel di agarosio (5 ore)
• Preparazione del DNA del vettore dai cloni positivi (5 ore)
• Crescita batterica, espressione e purificazione di una proteina ricombinante e analisi su SDS-PAGE (8 ore)
• Determinazione della concentrazione proteica in soluzione e set up di una piastra di cristallizzazione (3 ore)
• Misure di cinetica enzimatica (4 ore)
• Preparazione di una forma apo di un enzima (3 ore)
• Misura della costante di dissociazione proteina-ligando (2 ore)
Le esperienze di laboratorio, che sono obbligatorie, hanno lo scopo di mettere in pratica i concetti teorici studiati a lezione, sviluppare la capacità di pianificare un esperimento e interpretarlo, accrescere le capacità critiche e di giudizio.
